产品货号:
JN0020
中文名称:
Phi29 DNA聚合酶
英文名称:
Phi29 DNA Polymerase
产品规格:
125U|625U
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本制品是从Bacillus subtilis噬菌体Phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶,利用基因重组技术,在大肠杆菌中进行表达后经多次纯化分离而得。Phi29 DNA聚合酶具有特殊的链置换活性和高效的连续合成特性,对模板有很强的结合能力,可连续合成多达70kb的DNA片段而不从模板上解离。同时该酶具有很强3'→5'外切酶校正功能,保真性比Taq DNA聚合酶高100倍。
- 恒温protein-primed DNA扩增;
- 利用随机引物扩增DNA;
- 滚环复制;
- 复制extended-region。
- 极高的渗入率;
- 超强的链置换能力;
- 保真性高;
- 中温下反应。
组分 | 125U | 625U |
Phi29 DNA聚合酶(10U/μL) | 12.5μL | 12.5μL×5 |
10×Phi29 Buffer | 1mL | 1mL×5 |
100×BSA | 200μL | 200μL×5 |
dNTPs (10mM each) | 200μL | 200μL×5 |
保存:-20℃
10mM Tris-HCl(pH7.5),100mM KCl,1mM DTT,0.1mM EDTA,0.5% NP40,0.5% Tween 20,50% Glycerol。
65℃加热10分钟。
30℃条件下,10min内能使0.5pmol的dNTPs掺入酸不溶性物所需要酶量定义为1个活性单位。
经多次柱纯化,SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的条带,qPCR方法检测无大肠杆菌DNA残留,无核酸内、外切酶污染。
- 该酶缓冲液中含有还原剂DTT以便保证其最大酶活。故如果缓冲液不新鲜或经过反复冻融,使用前应添加4mM的DTT。
- 要求更高扩增效率的反应,请选择bjbalb改造的升级版Super Phi29 DNA聚合酶。
- 本制品灵敏度极高,注意防止模板污染。
- Phi29 DNA聚合酶具有极强的3'→5'外切酶活性,能够降解引物,扩增反应中应使用经过硫代修饰的随机引物。
- 常用反应体系(50μL):
成分 用量 10×Phi29 Buffer 5μL 随机引物(1mM) 1.25μL 菌液或质粒模板(5~10ng/μL) 1μL 加ddH2O至45μL,95℃预变性5min,立即冰浴5min dNTPs (10mM each) 2.5μL 100×BSA 0.5μL Phi29 DNA聚合酶(10U/μL) 2.5μL 30℃过夜 - 热失活:65℃,10分钟。
测序质粒模板的制备
优点:无需细菌培养、收集、裂解和质粒DNA的分离与纯化,不需要离心机和PCR仪。
- 样品处理:在平板上挑取单克隆到10μL无菌水中,取1μL进行反应。
- 样品预变性与质粒扩增:按照反应体系,先进行预变性,并使引物与质粒进行退火,加入其它成分后30℃扩增过夜。如选用Super Phi29 DNA聚合酶反应时间可缩短至1小时。
- 扩增效果检测(可选):将扩增产物稀释后进行琼脂糖凝胶电泳,如存在合适的酶切位点,可进行酶切反应检测。
- 热失活:65℃,10分钟。
- 测序反应:取上述反应液2μL加8μL无菌水,即可用于直接测序。
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